年轻与老年角膜内皮细胞的转录组比较

角膜内皮细胞位于角膜最内层，通过调节液体维持其透明度和厚度。本研究使用下一代测序（NGS）技术调查了年轻和老年角膜内皮细胞之间的转录组差异。来自年轻和老年供体的培养内皮细胞接受了NGS分析，以揭示转录组景观。通过Metascape进行的后续分析，解析了基因表达差异，揭示了关键生物通路。总共发现了568个差异表达基因，涉及内膜系统组织、核受体元通路、胞葬作用等。值得注意的是，在老年供体的老化细胞中观察到260个基因的表达减少，相关分析表明真核生物翻译起始、整合复合体和Hippo YAP信号传导显著。相反，308个基因在老年人中表现出升高的表达水平，与过渡金属离子运输和糖蛋白生物合成等过程相关。总之，我们的研究表明了参与角膜内皮细胞老化过程的关键基因，并阐明了其潜在的生物通路。这些见解对于选择治疗干预的目标至关重要，从而促进新型治疗策略的发展，以恢复和保持角膜内皮细胞功能。

引言部分：

角膜内皮细胞位于角膜最内层，通过调节液体维持其透明度和厚度。严重的损伤会导致角膜失明或大泡性角膜病变，需要进行角膜移植，因为角膜内皮细胞在体内具有非常有限的再生能力。角膜内皮细胞无法再生的机制包括细胞周期停滞、前房中丰富的负性细胞因子和衰老。衰老是衰老过程的一个重要标志，不仅在生物体的生理老化中起重要作用，而且在年龄相关疾病的发展中也起到关键作用。衰老类似于体内角膜内皮细胞伤口愈合，即细胞不增殖且增大。因此，了解年轻和老年角膜内皮细胞之间的差异对未来角膜内皮再生的治疗策略至关重要。已有关于老年和年轻供体之间角膜内皮细胞差异的报道，包括增殖能力、细胞周期动态和蛋白质表达。本研究采用下一代测序（NGS）分析年轻和老年角膜之间的转录组差异。NGS是一系列先进的测序技术，用于快速、高通量地分析DNA和RNA序列。基因表达分析涉及量化细胞中从基因产生的mRNA水平，提供有关这些细胞功能状态的见解。这种比较可以揭示由衰老影响的基因表达变化、调控机制和通路的重要见解。在本研究中，我们使用NGS分析了年轻和老年角膜内皮细胞之间的转录组差异，从而揭示了受衰老影响的调控机制和通路。

方法部分：

本研究遵循赫尔辛基宣言的原则，并经Hallym大学医学中心的机构审查委员会/伦理委员会审查和批准。细胞按照已发表的方法进行培养。角膜购自Eversight（密歇根州安娜堡），该公司已获得捐赠角膜的知情同意。由于在研究过程中不可能从研究对象或人体材料捐赠者处获得同意，Hallym大学医学中心的机构审查委员会/伦理委员会豁免了同意书。每个组使用了三名供体的角膜。人类角膜内皮细胞-后弹力层复合物在0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中孵育10分钟。细胞随后接种在涂有纤维连接蛋白-胶原组合（FNC）涂层混合物（美国巴尔的摩Athena环境科学公司）的6孔板中。细胞培养至汇合，时间为10-14天，然后以1:3的比例使用0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA溶液传代。年轻角膜供体的年龄为26.6±6.2岁（n=5），老年角膜供体的年龄为69.3±9.0岁（n=4）。

细胞形态评估和免疫荧光染色：

使用倒置荧光显微镜（Leica DMi8，德国威兹拉）评估细胞形态并获得显微图像。进行了ZO-1的免疫荧光染色。样品用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，随后在4%多聚甲醛溶液中固定20分钟。用0.5% Triton X-100溶液进行通透化处理10分钟，随后在25°C下用1%牛血清白蛋白（BSA）封闭一小时。在4°C下与几种抗体之一（鼠抗ZO-1，sc-33725，美国圣克鲁斯生物技术公司）过夜孵育。用PBS洗涤后，样品在黑暗中与FITC标记的山羊抗鼠IgG（1:100）室温孵育2小时，随后用Hoechst 33,342核染色试剂（1:2000；美国分子探针公司）复染。使用荧光显微镜（Leica DMi8）观察并记录图像。

转录组分析和差异表达基因（DEGs）分析及功能分析：

RNA提取严格按照ReliaPrep™ RNA Miniprep Systems（Promega，美国威斯康星州麦迪逊）进行，确保获得高质量的RNA用于进一步分析。RNA测序在Macrogen Inc.（www.macrogen.com）进行，使用先进的Illumina HiSeq 2000平台。这种高通量测序技术促进了对转录组的全面检查，实现了样本间基因表达差异的精确量化和识别。为了分析差异表达基因（DEGs），使用了edgeR包和R 3.6.3程序（R基金会，奥地利维也纳），这是一种专为检查RNA测序数据设计的强大统计工具。基于严格的标准，DEGs被确定为log2（倍数变化（FC））≥1且错误发现率（FDR）<0.05，以确保仅考虑基因表达的统计学显著变化。使用StringTie版本1.3.4d和DESeq2软件计算转录丰度并确认年轻和老年角膜内皮细胞之间的DEGs。使用每百万映射读段的转录本千碱基片段数（FPKM）计算转录丰度，提供标准化的基因表达水平测量。为了应对多重比较问题并减少I型错误的可能性，使用Benjamini-Hochberg算法仔细应用FDR控制，调整p值以更准确地反映真正阳性的发现。

功能注释和网络分析使用京都基因和基因组百科全书（www.kegg.jp/kegg/kegg1.html）或Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）进行，用于识别显著富集于DEGs中的代谢途径或信号传导途径。此外，STRING数据库（https://string-db.org/）和ShinyGO0.80用于网络分析和功能注释。调整后的p值<0.05的GO术语和通路被认为是显著富集的。

结果部分：

通过评估年轻和老年供体角膜内皮细胞的形态，获得了对细胞健康的洞察（图1A）。与年轻细胞相比，老年角膜内皮细胞较大。ZO-1的免疫荧光染色显示了ZO-1蛋白在细胞内的分布（图1B）。ZO-1是一种在紧密连接中发现的关键蛋白，紧密连接是将角膜内皮细胞紧密密封在一起的结构，形成屏障并控制分子的通过。ZO-1在细胞边界处呈现连续线，勾勒出细胞相遇并形成连接的位置。我们选择了所有显著上调和下调的mRNA，以绘制其表达的主成分分析（PCA）图、热图和火山图（图1C-1E）。显著上调和下调的DEGs见表1。NGS分析共鉴定了568个DEGs。其中，308个在老年供体的角膜内皮细胞中上调，260个下调。这些DEGs通过ShinyGO 0.80（http://bioinformatics.sdstate.edu/go/）和Metascape工具（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）进行了进一步分析。

总差异表达基因的富集分析：

通过Metascape进行的功能富集分析显示，年轻和老年角膜内皮细胞之间的DEGs在多个生物学过程中显著富集。这些过程包括内膜系统组织、核受体元通路、胞葬作用和细胞成分生物发生正向调控。此外，还观察到细胞对非生物刺激的反应、天冬氨酸型内肽酶活性正向调控（在淀粉样前体蛋白分解代谢过程中起关键作用）、蛋白聚糖生物合成、应激纤维组装正向调控和过氧化物酶体膜转运显著富集（p<0.05；见图2和表2）。

总差异表达基因的PPI富集分析见表3和图3。使用MCODE插件（一种用于识别PPI网络中功能模块的工具）进行了分析。得分最高的模块为翻译、真核生物翻译延伸、与外显子接合复合体（EJC）无关的无义介导衰变（NMD）、RMTs甲基化组蛋白精氨酸、程序性细胞死亡疾病、异染色质组织、高尔基相关囊泡生物发生、反式高尔基网络囊泡出芽、膜运输、COPI介导的前向运输、内质网到高尔基体前向运输、高尔基体运输及随后的修饰、过氧化物酶体蛋白输入、蛋白质定位、过氧化物酶体、RNA聚合酶II转录snRNA基因、DSS1复合体、整合复合体、NRAGE通过JNK发出死亡信号、细胞死亡信号传导通过NRAGE、NRIF和NADE、G alpha (12/13)信号事件。总差异表达基因的转录因子靶标富集分析（表4和图3C）导致了HIF1 Q5、MTF1 Q4、PAX6靶基因、PCGF1靶基因、GTF2E2靶基因、GTF2A2靶基因、PAX7靶基因、GGGYGTGNY未知、OCT C、ATXN7L3靶基因、FOXE1靶基因、CREB 02、SOX10靶基因和NFKB Q6的富集。

GO功能和KEGG通路分析：

使用ShinyGo 0.80和STRING数据库对DEGs进行了GO功能和KEGG通路分析。就Reactome而言，DEGs主要富集于RUNX2、FGFR、YAP1-和TAZ刺激的基因表达和细胞周期通路（图4A）。就KEGG通路而言，DEGs主要富集于Hippo信号通路、细胞周期、p53信号通路、TGF-β信号通路、肌动蛋白细胞骨架调控和HIF1信号通路（图4B和4C）。对于GO MF分析，DEGs主要富集于组蛋白去乙酰化酶活性、FGFR结合、CDK调节活性、生长因子受体结合和转录因子结合（图4D和4E）。GO分析显示，DEGs显著涉及细胞成分，如SMAD蛋白复合体、转录调节复合体、中心体和核质（图4F和4G）。

上调差异表达基因的富集分析：

上调DEGs的通路和过程富集分析见表5和图5。使用Metascape进行的功能富集分析显示，与年轻角膜内皮细胞相比，老年角膜内皮细胞中上调的DEGs在过渡金属离子运输、无机离子跨膜运输、糖蛋白生物合成过程、高尔基体运输及随后的修饰、Wnt信号通路正向调控、细胞外基质组织和胞葬作用方面显著富集。

上调DEGs的PPI富集分析见表6和图6。导致了RMTs甲基化组蛋白精氨酸、程序性细胞死亡疾病、小RNA转录调控、无机阳离子跨膜运输、单原子阳离子跨膜运输、无机离子跨膜运输、高尔基体相关囊泡生物发生、反式高尔基网络囊泡出芽、膜运输、FGFR2激活点突变、磷脂酶C介导的级联FGFR2和FGFR2配体结合及激活的富集。上调DEGs的转录因子靶标富集分析（表7和图6C）显示了HIF1 Q5、SOX10靶基因、PAX6靶基因、SRCAP靶基因、CDPCR3 01、OCT1 05、NFKB Q6和GABP B的富集。

下调差异表达基因的富集分析：

下调DEGs的通路和过程富集分析见表8和图7。使用Metascape进行的功能富集分析显示，与年轻角膜内皮细胞相比，老年角膜内皮细胞中下调的DEGs在高尔基体组织、真核生物翻译起始、整合复合体、Hippo YAP信号、细胞成分生物发生正向调控、病毒反应、Warburg效应由去泛素化酶及其底物调节、干细胞群体维持负向调控、DNA代谢过程、饥饿反应、分泌颗粒组织、水解酶活性正向调控、细胞对电离辐射的反应、质膜有界细胞投射组织调控、焦磷酸酶Akt mTOR信号通路、蛋白质分泌负向调控和碳水化合物代谢过程调控方面显著富集。

下调DEGs的PPI富集分析见表9和图8。导致了真核生物翻译延伸、翻译、RNA聚合酶II转录snRNA基因、DSS1复合体和整合复合体的富集。下调DEGs的转录因子靶标富集分析（表10和图8C）显示了NPM1靶基因、PCGF1靶基因、SNIP1靶基因、GTF2E2靶基因、PAX7靶基因、MTF1 Q4和CREB 02的富集。

讨论部分：

衰老对角膜内皮细胞有显著影响，导致细胞密度降低、细胞形态改变和再生能力下降。确实，了解角膜内皮细胞因衰老而发生的变化对于提出新的角膜内皮细胞再生治疗策略至关重要。本研究通过鉴定年轻和老年角膜内皮细胞之间的差异表达基因（DEGs），为衰老对角膜内皮细胞的影响提供了宝贵见解。受衰老影响的关键领域包括代谢、细胞死亡、细胞成分生物发生、蛋白聚糖生物合成和膜运输。这些结果强调了衰老对细胞功能复杂性的影响，尤其是在维持角膜透明度和视力方面起关键作用的角膜内皮细胞。鉴定特定生物过程中的DEGs表明，衰老可能导致细胞代谢发生重大变化，可能影响能量生产和重要成分的合成。细胞死亡机制的变化，包括凋亡，可能影响细胞周转和组织健康。细胞成分生物发生的改变表明其维持和更新结构成分的能力发生变化，这对于细胞完整性和功能至关重要。与蛋白聚糖生物合成相关的发现对角膜内皮细胞尤为重要，鉴于蛋白聚糖在维持细胞外基质和角膜水分中的重要性。最后，膜运输机制的改变可能影响角膜内皮细胞调节离子和液体平衡的功能，这对于角膜脱水和透明度至关重要。

在存在胎牛血清和FGF的情况下，来自老年供体的角膜内皮细胞比来自年轻供体的细胞增殖速度较慢，尽管来自老年供体的细胞可以进入并完成细胞周期。老年供体的角膜内皮细胞对EGF、培养基和其他环境条件的反应可能不同，强调了开发针对老年人群的治疗方法的重要性。已有报道指出，随着年龄增长，角膜内皮细胞的蛋白质表达会发生变化。来自老年供体的人类角膜内皮细胞显示出支持重要细胞功能（如代谢、抗氧化保护、蛋白质折叠和蛋白质降解）的蛋白质表达减少。角膜内皮细胞已被报告显示出异质的衰老标记表达，如MT2A、CDKN2A（p16）和TAGLN，并且随着传代次数增加，衰老标记CDKN2A和纤维化标记ACTA2增加。此外，有人建议在转变为衰老细胞后，会出现向纤维化细胞的转变。α-SMA、COL8A1和CD44被建议作为纤维化标记，而ZO-1和CD166被建议作为角膜内皮细胞标记，并且在向纤维化细胞转变的过程中同时减少。然而，在本研究中，衰老细胞和年轻细胞之间在角膜内皮细胞标记物ZO-1和CD166以及纤维化标记物α-SMA、COL8A1和CD44方面没有统计学差异。

衰老的分子机制包括基因组不稳定、端粒磨损、表观遗传改变、蛋白质稳态丧失、营养感应失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞耗竭和细胞间通讯改变。在本研究中，我们发现老年角膜内皮细胞中有308个上调和260个下调的DEGs。与衰老相关的分子如TGFB1、FGF7和IGFBP7以及功能分子ATP6AP1和ATP1B3在老年角膜内皮细胞中的表达增加，这与之前关于衰老与线粒体和氧化应激关系的研究结果一致。老年角膜内皮细胞中上调基因表达的增加表明两种可能性：这些基因可能直接促进衰老过程，或者它们可能是为了补偿伴随衰老的有害变化而上调。识别这些上调的DEGs为针对这些基因进行治疗干预提供了有价值的数据。通过抑制这些基因的作用，可能会减缓甚至逆转角膜内皮细胞中的一些衰老过程。这种方法可能涉及抑制衰老诱导的转录因子表达，从而通过对抗驱动衰老的分子机制来维持或恢复角膜内皮细胞。相反，老年角膜内皮细胞中下调的基因可能代表由于衰老导致的基本细胞功能的下降。这些基因可能涉及维持细胞健康、完整性和功能所需的必要通路。旨在强化或补充这些减少的DEGs的策略可以提供另一种对抗衰老的治疗途径。这可能涉及增强被衰老破坏的核心转录因子的表达，从而通过恢复对它们功能至关重要的转录调控网络来恢复角膜内皮细胞。在本研究中，下调的DEGs包括增殖基因如CDKL4、CDK2AP2P1、VEGFA、SINHCAF和CCDC144A，以及DNA修复基因如PARP4和POLG2。与蛋白质稳态相关的基因如UBXN2B、PSMG3、PSD3和ERLIN2也被下调。

我们发现了由衰老上调和下调的转录因子靶标。通过抑制上调DEGs的作用或增强下调DEGs的表达，针对这些分子变化进行干预，可以在分子水平上解决衰老的根本原因。此类干预不仅可以改善角膜内皮细胞的健康和功能，而且对衰老研究和治疗发展也有广泛的意义。HIF1在细胞对缺氧的反应中起着重要作用，通过激活与能量代谢、血管生成和其他影响衰老的过程相关的信号通路。MTF1，金属反应元件结合转录因子1，调节细胞对锌、铜和镉等重金属的基因表达，在金属代谢和解毒过程中起关键作用。它可能通过调节参与金属解毒和ROS清除的金属硫蛋白以及调节解毒和抗氧化反应相关基因来影响衰老。NPM1，核磷蛋白1，是一种多功能蛋白，通过调节p53通路、中心体功能、核糖体生物发生和氧化应激反应影响衰老。PCGF1是多梳抑制复合体1（PRC1）的组成部分，通过修饰染色质以维持基因的非活动状态。通过影响染色质结构和基因表达，PCGF1影响细胞衰老和衰老，并参与干细胞更新和分化。SNIP1，Smad核相互作用蛋白1，参与TGF-β信号传导、p53活性、细胞应激反应和细胞周期调控。逆转和调节细胞衰老可能有助于抑制衰老和再生角膜内皮细胞，在此过程中转录因子可能发挥重要作用。

总之，我们的研究揭示了参与角膜内皮细胞衰老过程的关键基因，并对其相关生物通路进行了深入探索。鉴定与衰老相关的基因和转录因子为开发靶向疗法奠定了坚实基础。这些疗法可能防止角膜内皮细胞衰老，并为创新的角膜内皮细胞再生方法铺平道路。

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